甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒提高抗肿瘤药物对肝细胞癌的靶向性和疗效

【摘要】肝癌、肝炎等肝脏疾病是严重威胁人类健康的常见病和多发病,常规剂型的药物经静脉注射、口服或局部注射后,药物非特异性分布于全身,毒副作用较大。靶向给药系统通过载体可将药物选择性递送至肝脏的病变部位,可降低对正常组织和全身的毒副作用,减少给药剂量和给药次数,提高药物功效。其中两亲性聚合物纳米粒作为给药载体,可提高难溶性药物的溶解性和稳定性、延长血液循环时间、改善药物体内分布,并具有良好的缓控释效果。聚合物纳米粒表面经特异性配体(GL)修饰,可实现药物对肝癌细胞的主动靶向。据此,设计并研究新型肝靶向性聚合物纳米粒-甘草酸(GL)修饰羧甲基壳聚糖纳米粒(CMCNP-GL),以紫杉醇(PTX)为抗肿瘤模型药物制备载药纳米粒,研究PTX/CMCNP-GL的理化性质、载药与释药、体外细胞摄取与体内组织分布、体外细胞增殖抑制与体内抑瘤率,考察不同GL取代度对PTX/CMCNP-GL体内外肝癌细胞靶向性及抗肿瘤效果的影响,并通过体内外试验初步评价CMCNP-GL载体的安全性。1CMCNP-GL的制备与表征以O-羧甲基壳聚糖(O-CMC)为亲水主链,甲基丙烯酸甲酯(MMA)为疏水单体,在APS引发剂作用下,通过自由基聚合法制得具有核壳结构的羧甲基壳聚糖纳米粒(CMCNP)。高碘酸钠氧化甘草酸制备GL醛,经氨醛缩合与硼氢化钠还原反应将GL醛接枝至CMCNP表面游离氨基,制得CMCNP-GL。改变投料比合成不同GL取代度的CMCNP-GL1、MCNP-GL2和CMCNP-GL4、FTIR、1HNMR、DSC表征CMCNP-GL的结构,TEM观察纳米粒形态,分别测定GL取代度、接触角、粒径和Zeta电势,并研究CMCNP-GL在不同条件下的稳定性。结果表明CMCNP-GL1、CMCNP-GL2和CMCNP-GL4中的GL取代度分别为2.4%、6.9%和9.6%;CMCNP-GL为大小均一的球形粒子,平均水合动力学粒径为100～250nm,生理条件下荷恒定负电(–30mV)。随GL取代度的增大,粒径先增加后减小,Zeta电势无明显改变,纳米粒表面亲水性逐渐增强。CMCNP-GL具有良好的冻干和贮存稳定性,不同的pH、离子强度及生理条件下理化性质均保持稳定。2载紫杉醇CMCNP-GL的制备、表征及体外释药特性以PTX为模型药物,研究CMCNP-GL作为难溶性抗肿瘤药物载体的特点。超声法制备不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL,测定其平均水合动力学粒径为110～205nm,生理条件下Zeta电势约为-30mV,与相对应的空白纳米粒粒径与Zeta电势基本相同。不同GL取代度的CMCNP-GL载药量与包封率均随GL取代度的增加而增大,对PTX的包封率均高于69.0%,最高可达81.5%；载药量均高于13.0%,最高可达15.1%。PTX/CMCNP-GL的体外释放表现为先突释后缓释的释放行为,PTX释放速率随GL取代度的增加而减慢,均显著低于PTX/CMCNP,表明GL表面修饰可增强CMCNP对PTX的缓释能力。不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL在各时间点的累积释放百分率无显著性差异。3载紫杉醇CMCNP-GL的体内外靶向性制备罗丹明B(RhB)荧光标记纳米粒RhB-CMCNP和不同GL取代度的RhB-CMCNP-GL,以肝癌细胞SMMC-7721与正常肝细胞L02为细胞模型,研究纳米粒的细胞黏附、细胞摄取、摄取机制与亚细胞定位。CMCNP-GL在二种细胞的黏附率和摄取率均显著高于CMCNP,不同GL取代度的CMCNP-GL在肝癌细胞的黏附率和摄取率均显著高于正常肝细胞,不同GL取代度的CMCNP-GL之间无显著性差异。游离GL分子可与肝细胞表面GL特异性结合位点相互作用,竞争性抑制CMCNP-GL的摄取,对CMCNP的摄取无影响,该抑制作用在肝癌细胞中比正常细胞显著。CMCNP-GL2主要经小窝蛋白及网格蛋白介导的内吞途径入胞,摄取过程具有能量依赖性,且与细胞的骨架重构有关。GL修饰对CMCNP的内吞途径无显著影响,入胞后主要聚集在细胞核周围的胞质中。以H-22肝癌荷瘤小鼠为模型,分别考察空白纳米粒与载药纳米粒经静脉注射后的体内分布,评价纳米粒的靶向性。结果表明PTX/CMCNP-GL2可显著减缓PTX在血液中的清除速率,改善PTX的体内分布,聚集于肝脏和肿瘤,显著降低PTX的心脏和肾脏毒性；PTX/CMCNP-GL2对肝癌组织的靶向性显著高于未修饰的PTX/CMCNP和PTX注射液。空白载体与载药纳米粒的体内分布趋势一致。4载紫杉醇CMCNP-GL的体内外抗肿瘤功效及安全性以SMMC-7721细胞为肝癌细胞模型研究PTX/CMCNP抑制肿瘤细胞增殖或诱导细胞凋亡的能力；以H-22肝癌荷瘤小鼠为模型,考察载药纳米粒的体内抗肿瘤功效,比较不同GL取代度对载药CMCNP体内外作用功效的影响。结果表明PTX/CMCNP-GL可显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的体外增殖,72h的IC50为2.7～3.2mg·ML-1,显著低于PTX注射液(13.5mg·mL-1)和PTX/CMCNP(8.1mg-mL-1).不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL之间无显著性差异。PTX可诱导一定程度的肝癌细胞凋亡,24h的凋亡率均为1020%,CMCNP纳米载体及其GL表面修饰对PTX引起细胞凋亡的机制和效果无显著影响。静脉注射PTX/CMCNP-GL可有效抑制H-22荷瘤小鼠的肿瘤生长,延长肿瘤倍增时间。PTX/CMCNP-GL的抑瘤效果最佳,平均抑瘤率为87.4%,分别约为PTX注射液和PTX/CMCNP的2.5和1.6倍,表明PTX经CMCNP包载后,抗肿瘤效果显著增强,不同GL取代度PTX/CMCNP-GL的抗肿瘤效果无显著差异。考察CMCNP-GL空白载体的细胞毒性、血液相容性、急性毒性和亚急性毒性,从细胞、组织和动物整体水平初步评价CMCNP-GL的安全性。FDA/PI双染色、LDH、中性红、蛋白质含量测定试验结果表明正常肝细胞L02和肝癌细胞SMMC-7721与不同GL取代度CMCNP-GL(5mg·mL-1)短时间(6h或24h)作用后,胞外LDH释放量、胞内中性红摄入量、蛋白质含量均无显著变化,细胞活力无显著影响；MTT试验结果表明二种细胞与CMCNP-GL(5mg·mL-1)较长时程(72h)共培养后,细胞增殖率无显著影响,CMCNP-GL细胞毒性低。CMCNP-GL溶血率低于5%,血浆复钙时间较长,动态凝血率低于硅化玻璃,具有一定的抗凝血效果,血液相容性良好。CMCNP-GL小鼠尾静脉给药最大耐受剂量为1800mg·kg-1;亚急性毒性试验中连续15天静脉注射给予CMCNP-GL2(1800mgkg-1),小鼠体重增长正常,血液学指标和肝功能指标ALT/AST/ALP正常,主要器官重量正常,组织切片中未见炎症、坏死、水肿等病理现象,表明CMCNP-GL2静脉注射安全性好,不引起肝损伤和全身毒性。
【作者】施丽丽；
【导师】印春华；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2013，博士
【关键词】聚合物纳米粒；羧甲基壳聚糖；甘草酸；紫杉醇；靶向给药系统；主动靶向；肝细胞癌；细胞摄取；生物分布；靶向效率；抗肿瘤功效；生物相容性；

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